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【伯豪生物】干货 | 细胞表型检测

2019-10-14点击9次
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我们在前面,花了很多篇幅讲述了Loss of Function和Gain of function的各种方法。?#25970;次?#20204;将目的基因在细胞中敲除、敲降、过表达之后,怎样?#33455;科?#21151;能呢?首先可以进行的,就是细胞表型检测。这一回,我们就来讲述细胞表型检测

细胞表型是涉及基因和蛋白表达的多个细胞过程的集合体,这些过程导致细胞特定的形态和功能。细胞表型检测,检测的是如下若干表型:周期、增?#22330;?#20939;亡、迁移、侵袭、克隆形成、自噬、EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,上皮间充?#39318;?#21270;)、血管生成。

在细胞内,将某目的基因敲除、敲降、过表达,建立稳转株后,与对照细胞一起,检测细胞表型,观察每项表型的变化,可推?#32454;?#30446;的基因的功能。

细胞周期

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。细胞内的DNA含量随着细胞周期进程发生周期性变化。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,可透过凋亡?#22411;?#26399;的细胞和死细胞,嵌入核酸DNA或RNA双链螺旋的碱基之间,使细胞核红染,并且荧光强度和所嵌入的核酸含量成正?#21462;?#32454;胞周期检测时,首先用RNA 酶将RNA消化排除影响,通过流式细胞术检测PI荧光强度直接?#20174;?#32454;胞各时相的DNA分布状态,从而计算出各时相的百分率。

细胞增殖

细胞增殖是生物体的重要生命特征。细胞以分裂的方式进行增?#22330;?#21333;细胞生物以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物以细胞分裂的方式产生新的细胞,用来补充体内衰老和死亡的细胞;同时,多细胞生物可以由一个受精卵,经过细胞的分裂和分化,最终发育成一个新的多细胞个体。一般细胞传代之后,经过短暂的悬浮然后贴壁,随后经过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后,停止生长,进入平台期,然后退化衰亡。可以用存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图,得到生长曲线,可准确描述整个过程中细胞数目的动态变化。目前主要使用MTT、CCK8和Am-blue三?#36136;?#21058;测定细胞生长曲线。

细胞迁移

细胞迁移是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移为细胞头部伪足的?#30001;臁?#26032;的黏附建立、细胞体尾部收缩在时空上的交替过程。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一,是机体正常生长发育的生理过程,也是活细胞普遍存在的一种运动形?#20581;?#32986;胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、?#23383;?#21453;应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。检测细胞迁移能力的实验包括划痕实验和Transwell实验。细胞划痕实验是,在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上,用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线,去除中央部分的细胞,然后继续培养细胞至实验设定的时间,观察细胞。Transwell的基本原理是将transwell小室放入培养板中,小室内称为上室,培养板内称为下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,上室内添加上层培养?#28023;?#19979;室内添加下层培养液。将细胞种在上室内,由于膜?#22411;?#36879;性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以?#33455;?#19979;层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

细胞侵袭

细胞侵袭实验的目的是?#33455;?#36235;化因子或其他营养物质对细胞侵袭的影响。将细胞种于上室,趋化因子等种于下室,细胞会向营养成分高的下?#36951;堋?#19982;迁移实验不同是侵袭实验需要在小室聚碳酸酯膜上铺设一层基质胶。用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶?#21040;猓?#26041;可通过聚碳酸酯膜。计数进入下?#19994;?#32454;胞量可?#20174;?#32959;瘤细胞的侵袭能力。

细胞凋亡

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动、高度有序、基因控制的一系列酶参与的过程。?#23383;?#37232;丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。用标记上荧光素或biotin的Annexin V(一种Ca2+依赖性?#23383;?#32467;?#31995;?#30333;,与PS高亲和力特异性结合)与PC结合,利用流式细胞仪或荧光显微镜,即可检测细胞凋亡的发生。将Annexin V与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

克隆形成

克隆形成是测定细胞增殖能力的有效方法之一。单个细胞在体外?#20013;?代以上,其后代所组成的细胞群称为克隆。这时每个克隆含有50个以上的细胞,大小在0.3-1.0 mm之间,通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增殖潜力做定量分析,了解细胞的增殖能力和独立生存能力。常用的方法有:平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。悬浮细胞克隆形成检测可使用软琼脂克隆形成实验。

细胞自噬

细胞自噬是通过溶酶体进行蛋白?#21040;?#21644;细胞组分调节的过程。自噬主要受细胞内的营养匮乏?#30899;?#32780;产生,在生物体内发育、分化、环境胁迫和肿瘤发生?#33455;?#26377;重要的意义。?#33455;?#21457;现微管相关蛋白轻链3(MAP-LC3),简称LC3,参与了自噬的形成,并被证明了是哺乳动物细胞中常见的自噬小体标记蛋?#23383;?#19968;。可在细胞中表达LC3-GFP融?#31995;?#30333;,对自噬体的形成和功能进行监控。由于自噬涉及多条信号通路,可以诱导或抑制其发生。细胞自噬与个体发育、氧化性损伤保护、肿瘤细胞的恶性增殖及神经退行性疾病有关。因此,可在相关疾病?#33455;?#20013;检测自噬,?#33455;?#22522;因功能。

EMT

EMT,?#24178;?#30382;细胞-间充?#39318;?#21270;的缩写,是?#24178;?#30382;细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过Western Blot的方法检测细胞中目的基因敲降或过表达后EMT marker蛋白表达量,可判断目的基因表达变化后是否能抑制EMT过程的发生,从而判?#32454;?#22522;因是否为转移相关基因。

血管生成

血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉新的毛细血管性血管的生长。无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤,一旦生长直径超过1~2 mm,都会有血管生成。这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子,诱导血管生成。体外血管生成实验能够很好的模拟肿瘤血管发生过程,并且适合?#33455;?#26576;些基因或药物对这一过程的影响。可以通过血管内皮细胞(HUVEC)在基质?#28023;∕atrigel)上形成血管的能力来判断某些基因或药物对血管形成的影响。

细胞表型典型图


伯豪生物提供各项细胞表型检测服务



细胞表型可大体反应出目的基因的功能,如促增?#22330;?#20419;凋亡等,可以对基因功能进行初步的验证。细胞增?#22330;?#20939;亡等都涉及到多条信号通路,而我们的目的分子,其敲除、敲降或过表达使细胞表型发生了变化,它是如何作用于哪条信号通路呢?要解答这个问题,请见下回:基因功能预测和信号通路?#33455;?#24037;具

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